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液相系統(tǒng)組件

  HPLC核心組件為進(jìn)行混合物分離的色譜柱。流動(dòng)相經(jīng)由高壓泵到達(dá)進(jìn)樣器，再流入色譜柱，最后進(jìn)入質(zhì)譜儀。

  讓我們先從高壓泵開(kāi)始：該泵通過(guò)過(guò)濾器從流動(dòng)相瓶中吸取溶劑，對(duì)溶液進(jìn)行加壓，使得溶劑能夠克服柱填料以及管路的阻力，并將溶劑泵入進(jìn)校器。雖然目前大部分儀器都含有脫氣模塊，但仍推薦采用超聲法對(duì)流動(dòng)相溶劑進(jìn)行脫氣，防止管路中出現(xiàn)氣泡。HPLC系統(tǒng)常采用往復(fù)式活塞泵：它由鉆出的金屬體組成，以提供泵送腔，泵送腔在背面用特氟龍密封，通過(guò)特氟龍密封件驅(qū)動(dòng)惰性活塞。帶有止回閥的入口和出口端口允許溶劑進(jìn)入和退出泵腔。入口止回閥關(guān)閉以防止在活塞行程的增壓部分溶劑跑回溶劑庫(kù)。同時(shí)，出口止回閥打開(kāi)，允許溶劑輸送到通往注射器的管路。當(dāng)凸輪驅(qū)動(dòng)馬達(dá)將活塞拉回時(shí)，進(jìn)油單向閥打開(kāi)以容納更多的溶劑，而出油單向閥關(guān)閉以防止加壓溶劑從噴油器管路中流回。泵運(yùn)行的關(guān)鍵是活塞和活塞密封。的泵活塞由綠寶石玻璃制成，通常被稱為藍(lán)寶石活塞。順便說(shuō)一句，藍(lán)寶石活塞不是藍(lán)色的，但它的名字有助于證明必須更換破損活塞的成本?；钊仄潋?qū)動(dòng)軸線方向具有很大的強(qiáng)度，但很容易在軸線上折斷。大多數(shù)泵的設(shè)計(jì)是為了避免活塞抖動(dòng)，所以見(jiàn)的破壞活塞的原因是密封上的緩沖器積聚和泵頭拆卸時(shí)的破壞，以檢查活塞的狀況。

  密封是對(duì)泵運(yùn)行至關(guān)重要環(huán)節(jié)。它是由一個(gè)聚四氟乙烯的圓環(huán)，內(nèi)含一個(gè)中心有孔的嵌入式圓鋼彈簧，泵活塞通過(guò)這個(gè)圓環(huán)。這種油炸圈形狀的密封件適合在泵頭后部的圓形凹陷中，不像密封件的厚度那么深。當(dāng)泵頭用螺釘固定在泵端面時(shí)，密封被壓縮，彈簧擠壓到泵活塞上。它在活塞的行程中前進(jìn)和后退時(shí)，在活塞周圍形成一個(gè)高壓液體屏障。當(dāng)活塞通過(guò)特氟龍密封時(shí)，泵腔中的液體潤(rùn)滑活塞，當(dāng)活塞上的薄膜到達(dá)密封外側(cè)時(shí)，液體蒸發(fā)。流動(dòng)相中的緩沖劑或離子對(duì)試劑在活塞上結(jié)晶，在回程上被密封件擦去。如果它們不擦掉或沒(méi)有被洗掉，它們就會(huì)堆積并將活塞變成一把鋸子，鋸子穿過(guò)特氟龍，產(chǎn)生泄漏，需要定期更換密封。密封更換是見(jiàn)的操作，如果不正確的話，會(huì)導(dǎo)致活塞斷裂。

 驅(qū)動(dòng)凸輪和壓力傳感器是影響泵運(yùn)行的另外兩個(gè)部件。這種類型泵的基本問(wèn)題是脈沖。泵的一部分時(shí)間是向柱體加壓和驅(qū)動(dòng)溶劑，活塞的一部分時(shí)間是重新填充溶劑室。泵腔內(nèi)壓力上升和下降，導(dǎo)致通過(guò)出口單向閥輸送的溶劑脈沖。通過(guò)使用反向多泵頭、電子泵電機(jī)控制、脈沖阻尼三種方法克服了這一問(wèn)題。如果有兩個(gè)泵頭在不同的時(shí)間通過(guò)T型管向同一溶劑管線供料，脈動(dòng)減小。其中一個(gè)可以重新填充，而另一個(gè)則驅(qū)逐出溶劑。顯然，這種方法通過(guò)添加組件和工程增加了泵的成本，但確實(shí)產(chǎn)生了的溶劑輸送。通過(guò)對(duì)泵電機(jī)進(jìn)行電子控制，使其在補(bǔ)料和再增壓行程中加速運(yùn)動(dòng)，可以設(shè)計(jì)出在輸送模式下花費(fèi)大部分時(shí)間的單柱塞泵。這種泵浦仍然是脈沖的，但是脈沖性大大降低。它的性能不如一個(gè)好的雙頭泵，但它的建造成本明顯較低。

  脈沖阻尼器是減少液體脈沖的最后組件。沒(méi)有廠家愿意承認(rèn)其泵需要脈沖阻尼器，但所有廠家都使用。在泵的出口閥和進(jìn)樣器之間有兩條線進(jìn)出金屬的裝置可以是壓力傳感器、壓力傳感器或脈沖緩沖器。在高壓泵上切開(kāi)脈沖緩沖器，你會(huì)發(fā)現(xiàn)它包含一個(gè)非常細(xì)的內(nèi)徑不銹鋼油管的長(zhǎng)的、壓縮的線圈。當(dāng)脈沖發(fā)生時(shí)，這個(gè)螺旋管拉伸然后再次壓縮，通過(guò)彈簧效應(yīng)阻尼脈沖。壓力變送器也有油管進(jìn)出和信號(hào)線出來(lái)。內(nèi)部是帶有傳感器的彎曲的油管線圈。隨著壓力的增加，管路發(fā)生拉伸，這種偏轉(zhuǎn)可以通過(guò)傳感器測(cè)量，并將信號(hào)發(fā)送到泵前的壓力表。在進(jìn)行需要惰性條件的分離時(shí)，重要的是要理解這些裝置是存在的。兩者都含有不銹鋼，可以被高濃度的鹽腐蝕，并且可以污染金屬敏感的酶純化物。

  HPLC系統(tǒng)中的第二個(gè)硬件部件是進(jìn)樣器?；钊竭M(jìn)樣器是的進(jìn)樣器類型。在閥門的一個(gè)位置，來(lái)自泵的高壓液體流經(jīng)內(nèi)部旁路流出至HPLC柱。閥門的另一側(cè)連接小口徑回路、注入口和廢液排出器。

  溶解在流動(dòng)相中的樣品從注射器注入到定量環(huán)中，使定量環(huán)過(guò)量至少20 %。也可以使用部分進(jìn)樣，只要緩慢進(jìn)樣并保持不超過(guò)循環(huán)體積的75 %，以避免從進(jìn)樣口丟失樣品。接著，將注射器手柄快速轉(zhuǎn)動(dòng)到注射位置。樣品從環(huán)路后端洗出，給予次進(jìn)樣/先出樣以維持樣品濃度。自動(dòng)進(jìn)樣器通常采用這種類型的回路和閥門布置，盡管它們可能將樣品拉入回路而不是推入。他們還使用多種清洗方案，以避免從瓶子移動(dòng)到瓶子進(jìn)行后續(xù)注射時(shí)的樣品攜帶污染。

  HPLC系統(tǒng)中的第三個(gè)硬件部分是檢測(cè)器。在LC / MS系統(tǒng)中，這將是質(zhì)譜儀的檢測(cè)器之一，但其他HPLC檢測(cè)器可能被用于從色譜柱的同一溶劑流中，或者與質(zhì)譜儀串聯(lián)，或者使用分流器將部分或大部分流出液分流到二級(jí)檢測(cè)器，如折射率( RI )檢測(cè)器、電導(dǎo)率檢測(cè)器、紫外( UV )檢測(cè)器或熒光檢測(cè)器( FL )。所有這些二級(jí)峰檢測(cè)器必須使用非常低的死體積流通池，以防止分離的色譜峰重新混合或用流動(dòng)相稀釋。每一個(gè)都提供了峰成分的額外信息。折射率和電導(dǎo)率檢測(cè)器主要是質(zhì)量檢測(cè)器，其峰面積(或高度)與每個(gè)峰中物質(zhì)的量成正比。熒光計(jì)對(duì)吸收紫外光的特定材料發(fā)生反應(yīng)，并在較高波長(zhǎng)處重新發(fā)射。紫外檢測(cè)器是的HPLC檢測(cè)器?？勺兲綔y(cè)器可以設(shè)置為只在特定波長(zhǎng)下吸收的化合物，而二極管陣列紫外探測(cè)器可以在陣列可用的波長(zhǎng)范圍內(nèi)檢測(cè)吸收紫外光的化合物。

LC / MS系統(tǒng)的個(gè)硬件部分是一臺(tái)計(jì)算機(jī)，用于數(shù)據(jù)采集和處理。同進(jìn)用于控制所有系統(tǒng)模塊和獲取峰數(shù)據(jù)，量化峰面積，確定每個(gè)峰的組分分子量，識(shí)別雜質(zhì)，并將峰的裂解規(guī)律與已知數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，以確定目標(biāo)化合物。

梯度洗脫與等度洗脫系統(tǒng)

到目前為止，我們只描述了一個(gè)非常簡(jiǎn)單的液相系統(tǒng) ，一個(gè)便宜的單泵等度洗脫系統(tǒng)，能夠泵出一個(gè)不變的流動(dòng)相。改變儲(chǔ)庫(kù)中的溶劑可以產(chǎn)生溶劑的階梯梯度，用于洗脫或洗脫后期運(yùn)行的峰。對(duì)于許多專用的應(yīng)用程序，這可能是所需要的全部。復(fù)雜的溶劑分離和方法開(kāi)發(fā)需要一個(gè)更復(fù)雜的系統(tǒng)。相比于等度洗脫，梯度洗脫系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)更復(fù)雜混合物的分離。梯度系統(tǒng)對(duì)色譜柱上的物質(zhì)產(chǎn)生可重復(fù)的、連續(xù)變化的流動(dòng)相組成。種方法是添加第二個(gè)溶劑泵和貯液器、混合器和泵流量控制器，使一個(gè)泵的速度增加而另一個(gè)泵的速度減慢，產(chǎn)生雙泵梯度系統(tǒng)。溶劑的混合是在泵出口的高壓側(cè)進(jìn)行的，因此任何可能由混合熱釋放的溶解氣體都被迫返回到溶液中，直到它們退出檢測(cè)器流通池。第二種共梯度系統(tǒng)僅使用單個(gè)泵，但增加了多個(gè)貯液器、連接它們的可編程開(kāi)關(guān)閥、混合器以及控制泵流量和開(kāi)關(guān)閥的控制器。該系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是它的成本較低，因?yàn)橹恍枰粋€(gè)泵，并且有兩個(gè)以上的流動(dòng)相可用于生產(chǎn)梯度，用于方法開(kāi)發(fā)和自動(dòng)柱洗脫。

  在其他因素相同的情況下，由于開(kāi)關(guān)閥梯度系統(tǒng)在價(jià)格和性能上的優(yōu)勢(shì)，在任何情況下都是理想的選擇。然而，該系統(tǒng)產(chǎn)生的梯度不如雙泵梯度系統(tǒng)產(chǎn)生的梯度精確或可重復(fù)。開(kāi)關(guān)閥梯度系統(tǒng)還需要用氦氣對(duì)儲(chǔ)液器溶劑進(jìn)行脫氣。切換閥-混合器組合中溶劑混合不脫氣產(chǎn)生的熱量會(huì)導(dǎo)致泵頭中空氣被抽出溶液，造成空化，氣塞堵塞溶劑輸送至色譜柱。當(dāng)泵活塞通過(guò)進(jìn)氣閥拉入溶劑時(shí)，空氣中的氧氮混合氣在溶劑中形成大氣泡粘附在泵表面。氦在活塞行程的壓縮部分形成小的、不粘的氣泡，被迫返回到溶液中。

  大多數(shù)開(kāi)關(guān)閥系統(tǒng)提供了3個(gè)和4個(gè)溶劑庫(kù)，但3個(gè)和4個(gè)溶劑梯度的方法開(kāi)發(fā)非常復(fù)雜，以至于很少看到超過(guò)一個(gè)雙溶劑法的梯度，并且可能從第三個(gè)溶劑庫(kù)中添加另一個(gè)溶劑。第三種和第四種溶劑的主要用途是用于自動(dòng)化的色譜柱清洗和方法篩選，這兩種溶劑在用于LC / MS分析之前可能會(huì)被淘汰。從第三個(gè)儲(chǔ)庫(kù)中加入恒定水平的揮發(fā)性緩沖液可能是在LC / MS操作中保留的一種用途。

  涉及極性和揮發(fā)性范圍寬的溶劑的梯度方法向質(zhì)譜儀接口提出了問(wèn)題。接口的目的是雙重的。在不損失分析物的情況下，必須盡可能地除去溶劑，并使其組分揮發(fā)和電離，以傳輸至質(zhì)譜儀。在分離過(guò)程中，如果流動(dòng)相中含有過(guò)寬的極性變化，溶劑可能不能被除去，并且會(huì)抑制界面的電離和質(zhì)譜中的離子檢測(cè)。出于同樣的原因，涉及非揮發(fā)性緩沖液或離子對(duì)試劑的梯度在用于LC / MS之前必須作出一些調(diào)整。