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一、簡介：

不斷進行的工業(yè)發(fā)展和新技術(shù)改進應(yīng)用（例如，納米技術(shù)），都導(dǎo)致了空氣污染的不斷增加，導(dǎo)致了肺部**在過去幾十年里大大的增加。新的產(chǎn)品（例如，納米粒子的噴霧劑）已經(jīng)被廣泛應(yīng)用在電氣工業(yè)，日常消費和醫(yī)療應(yīng)用等等特別是噴霧或粉末形式應(yīng)用的產(chǎn)品，對人體健康被認為是特別有害的。由于增加了有害物質(zhì)的釋放，如，當使用納米噴霧劑的鞋護理，清潔劑，**噴霧劑，或在塑料等產(chǎn)品的技術(shù)加工過程，也就明顯增加肺部暴露機會。然而，對可吸入物質(zhì)的毒性及基本病理機制的研究卻了解甚少。自2006以來，歐盟化學(xué)品監(jiān)管規(guī)定（注冊，評估，和限制化學(xué)品，歐共體1907 / 2006），要求對現(xiàn)有的以及新推出的化學(xué)品進行毒性風(fēng)險評估，包括鑒定其潛在的吸入毒性危害。人體內(nèi)的毒理學(xué)數(shù)據(jù)是罕見的，因為人類中毒通常是偶然的，不可預(yù)測的，和不可控制的。具有相同或類似的實驗標本數(shù)據(jù)是非常困難的。此外，社會道德的原因，在人體內(nèi)開展肺毒性的研究也是不可行的。因此，毒理學(xué)數(shù)據(jù)通常在動物實驗中產(chǎn)生。然而，動物模型也具有其局限性，例如種間差異。此外，立法需要考慮“3R”原則（減少，優(yōu)化，和替代）及其發(fā)展，即需建立和驗證可替代目前動物試驗的方法。因此，一種以體外實驗為基礎(chǔ)的體外暴露染毒技術(shù)，進行肺毒理性評價研究是必須的。

二、細胞體外暴露染毒技術(shù)

1. 浸沒式體外暴露染毒

各種體外培養(yǎng)模型已經(jīng)被用來進行空氣中氣溶膠的急性毒性評價與研究。傳統(tǒng)浸沒式體外暴露染毒技術(shù)，是*簡單有效的一種體外暴露染毒研究方法，到目前為止，仍有許多實驗室正在使用。該方法首先是把細胞進行浸沒式培養(yǎng)，然后把需要暴露的氣溶膠物質(zhì)需溶于培養(yǎng)液后到達細胞表面，通過細胞與培養(yǎng)液相互作用的方式進行進行染毒實驗（如圖1所示）。

圖1 浸沒式體外暴露染毒模式圖

但是，對于肺內(nèi)上皮細胞，這種方式有別于真實的氣液界面暴露環(huán)境：1、暴露在浸沒條件下進行，導(dǎo)致氣溶膠特性存在潛在改變的可能；2、對于不溶于水的固體顆粒物，其在培養(yǎng)液中分布的均勻性較低；3、相比較于氣體，顆粒物在液體中的運動速度降低，與細胞接觸的效率降低。

2. 氣液界面體外暴露染毒

由于浸沒式體外暴露然染毒存在先天的缺陷，科學(xué)家們開始探索一種新的能夠更加真實模擬體內(nèi)生物效應(yīng)的體外暴露染毒技術(shù)。早在1975年，Voisin等人提出的氣液界面體外暴露染毒（ALI）的描述，這一描述為體外培養(yǎng)肺細胞的氣液界面暴露（ALI）提供了依據(jù)。這一理論中細胞既可以通過底膜獲取培養(yǎng)基，保證了細胞的體外存活率，又可實現(xiàn)與頂部與氣體（含受試物質(zhì)氣溶膠）直接暴露。

圖2 氣液界面體外暴露染毒模式圖

2.1 **代氣液界面細胞暴露染毒裝置CULTEX：1999年，根據(jù)Voisin等人的描述和Tarkington等人關(guān)于動態(tài)暴露染毒的概念，德國漢諾威醫(yī)學(xué)院毒理學(xué)教授Dr. Ulrich Mohr、Dr. Michaela Aufderheide等人，成功開發(fā)了**代體外細胞培養(yǎng)與暴露的染毒的裝置，即基于線性流的體外暴露染毒模塊Cultex CG（如 圖3）

圖3 CULTEX CG (線性流體外暴露染毒系統(tǒng)Linear Flow System)

**代氣液界面體外暴露染毒系統(tǒng)，主要特點是氣路呈線性流分布。主要結(jié)構(gòu)有上下兩個模塊，兩模塊形成緊密的封閉系統(tǒng)。其中下部模塊為細胞培養(yǎng)部分，實驗室細胞培養(yǎng)小室置于其中，小室底部具備37℃水浴及可流動的培養(yǎng)基供給；上部是與培養(yǎng)小室對應(yīng)分布的線性的氣體進出模塊，通過在后端連接的抽氣泵，在密閉腔室內(nèi)實現(xiàn)負壓，所需暴露物質(zhì)不停進入密閉系統(tǒng)內(nèi)完成暴露染毒后才從后端排出。細胞培養(yǎng)小室中形成良好的細胞培養(yǎng)環(huán)境，其中的細胞并可與頂部進來的氣體進行直接接觸，實現(xiàn)直接的氣液界面暴露。

2.2 **代氣液界面細胞暴露染毒裝置CULTEX RFS：

在受試物為氣體時，氣路設(shè)計是否為線性排列，并不重要，因為，氣體的分布是均勻的。但當受試物為顆粒物氣溶膠時，由于其具有復(fù)雜顆粒物粒徑大小分布及物理化學(xué)性質(zhì)，其線性方向運輸將對其顆粒物的沉積產(chǎn)生非常大的影響。（1）顆粒物濃度及粒徑分布在稀釋系統(tǒng)中的穩(wěn)定性收到影響；（2）在不同的細胞小室上沉積的粒子濃度及粒徑將發(fā)生變化，導(dǎo)致在不同的細胞小室內(nèi)沉積顆粒的平行性和重復(fù)性較差。顯然，壓縮空氣的進氣稀釋是無法打破受試物質(zhì)的層流分布，這將無法改變?nèi)缟纤龀练e效應(yīng)的產(chǎn)生。

考慮到這些缺點，細胞培養(yǎng)小室和氣溶膠入口分布需要進行根本性的改變。為了避免受試顆粒物暴露的不均勻性，Cultex推出全新概念的二代暴露染毒模塊Cultex RFS（圖4、圖5）。

圖4 CULTEX RFS外觀圖 圖5 CULTEX RFS內(nèi)部氣路圖

在這里，氣溶膠將通過一個帶有噴嘴(Mohr, 2013)的入口統(tǒng)一進入，在噴嘴處氣溶膠將均勻分散到三個輻射分布的通道內(nèi)，通過該通道進入輻射分布的細胞培養(yǎng)室內(nèi)，如此過程后，氣溶膠在三個細胞小室內(nèi)沉積的均一性和重復(fù)將大大提高。該實驗中不同顆粒沉積后的圖片和數(shù)據(jù)結(jié)果都顯示了非常好的效果，三個細胞小室間顆粒沉積偏差和標準偏差都非常理想。與**代線性流系統(tǒng)比較，我們發(fā)現(xiàn)二代輻射流暴露染毒模塊損失了部分顆粒，即每個細胞小室內(nèi)沉積顆?？傎|(zhì)量在減少。這是由于Cultex RFS模塊中我們增加了大顆粒物（凝聚粒子）預(yù)分離技術(shù)，降低了大的或凝聚在一起的顆粒沉積到細胞表面的可能，即提供了顆粒物粒徑分布的均一性，使實驗受試物更穩(wěn)定，既減小了粗顆粒對實驗的影響，又進一步提高了實驗重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2.3 第三代氣液界面細胞暴露染毒裝置CULTEX RFS COMPACT：

圖6 COMPACT結(jié)構(gòu)圖

氣液界面細胞暴露染毒發(fā)展到**代技術(shù)CULTEX RFS，已經(jīng)具有非常高的實驗重復(fù)性和穩(wěn)定性，但在實際應(yīng)用中仍有一些問題，比如通道數(shù)量較少，只有3個暴露通道，且所有通道暴露同一氣溶膠物質(zhì)，缺少對照實驗組。為此德國CULTEX實驗室技術(shù)公司在2015年推出第三代氣液界面細胞暴露染毒裝置CULTEXRFS COMPACT（見圖6），COMPACT繼承了CULTEX RFS的輻射流設(shè)計等主要優(yōu)點外，增加了細胞暴露腔室數(shù)量達6個，共分為兩組，進行對比試驗。同時優(yōu)化減少了每個腔室細胞培養(yǎng)基加入量，整體采用電加熱恒溫系統(tǒng)，更靈巧便捷，易于進行室外大氣試驗。

這便是氣液界面細胞暴露染毒技術(shù)的發(fā)展過程，在早期主要是細胞系（如A549）以及原代細胞（如巨噬細胞）被用于在急性吸入毒理學(xué)領(lǐng)域的劑量-反應(yīng)關(guān)系的建立。隨著時間的推移，體外暴露染毒系統(tǒng)已經(jīng)變得越來越復(fù)雜，現(xiàn)在已經(jīng)可以用于對呼吸道不同部位分化培養(yǎng)的3D細胞進行體外暴露染毒研究，特別是近期CULTEX推出的InsertCup裝置，可以很好的在體外建立細胞共培養(yǎng)模型。CULTEX復(fù)雜的體外暴露染毒系統(tǒng)的發(fā)展也為毒理學(xué)測試策略開辟了新的領(lǐng)域。除了在急性吸入毒理學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)形成穩(wěn)定的驗證方法外，多次重復(fù)體外暴露染毒概念，特別是無毒劑量實驗已經(jīng)在亞急性試驗領(lǐng)域得到開展。

目前，體外暴露染毒技術(shù)的主要興趣是：在體外更真實的模擬人類體內(nèi)的生物效應(yīng)，開展各種實驗物質(zhì)的體外暴露染毒實驗。